1. 什么是western blot?
答：WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。
2. western blot 有什么优点？
答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。
3. western blot 的具体步骤是什么？
答：一. 制样（以提动物组织总蛋白为例），
1） 组织洗涤后加入3 倍体积PBS，0℃研磨。
2） 加入5×STOP buffer
3） 180W, 6mins，0℃超声波破碎
4） 5000rpm，5mins 离心，取上清。
5） 加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）
6） 煮沸，10min
7） 分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
二． 电泳（SDS-PAGE）
建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5
％胶。
1）配胶（one piece）A.分离胶。单位：ml。Total: 8ml
7.5％ 10％ 15%
2×Sep. buffer 4 4 4
30％ Gel.sol 2.0 2.7 4
ddH2O 1.9 1.2 0
TEMED 8ul 8ul 8ul
10%APS 80ul 80ul 80ul
B. 浓缩胶。单位：ml。Total: 3.5ml
3％
2×Stacking. buffer 1.7
30％ Gel.sol 0.35
ddH2O 1.4
TEMED 5ul
10%APS 50ul
2)点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则
载荷面为：1mm×5mm=5mm2)，
3）电泳。开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。
4）转移（一块胶）。
A.半干法。
a. 取六张滤纸（Bio-Rad，1mm），三张做上层滤纸，三张做下层。其中，
上层滤纸一定要比较干净，无污染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少
五分钟。
b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后，再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。阳极上铺三张下层滤纸，再浸泡过的膜，再铺胶，然后铺三
实验方法互助区——蛋白区
张上层滤纸，最后铺上三张上层滤纸，盖上阴极。注意每层之间不能有
气泡。膜上用铅笔画出胶的边缘。标上下。
d. 转移，0.8mA/cm2-3mA/cm2. 经验是：100kd-200kd，用2mA/cm2，2hrs;
30-100kd用1.0-2.0mA/cm2，40mins-1.5h；10kd-30kd％用0.5-0.8mA/cm2，
15mins-40mins.
B.湿法。
a. 取四张滤纸，两张做上层滤纸，两张做下层。其中，上层滤纸一定要比较
干净，无污染。
b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transfer
buffer 浸泡。
c. 做三明治。
e. 转移。抗原≥100kd, 先28V转移1h, 然后84V转移14-16h, ≤100kd， 则
63V转移4-16h.
三封闭：5％牛奶4℃封闭过夜，或RT 1hr.
四第一步反应：5％牛奶或2％BSA稀释抗体（称一抗），稀释比例按抗体说明,室温
孵育1hr，
五洗涤：TBST 洗5 mins 3-5 次。
六第二步反应：将膜跟5％牛奶或2％BSA稀释的2 抗一起孵育，室温1hr。
七洗涤：TBST 洗5 mins 3-5 次。
八显色：
4. western blot 所需buffer 的配方是什么？
答：主要的buffer有：
1） 2×Separation buffer (PH: 8.8)
0.75M TRIS.HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS
Total: 1000ml
2) 30% gel Solution
0.8% kis-aciylamide 0.8g
29.2% aciylamide 29.2g
Total: 100ml
3）10％ APS: 0.1g 溶于1.0ml ddH2O.
4) 2×Stacking buffer(PH: 6.8)
0.2M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS
Total: 500ml
5) 10×Running buffer(PH: 8.3)
250mM Tris 60.55g
1.9M Glycine 285.27g
1% SDS 20g or 100ml 20% SDS
Total: 2 liters
6) Semi-dry transfer buffer(PH:8.3):
48mM Tris 5.8g
39mM Glycine 2.9g
0.037% SDS 0.37g
实验方法互助区——蛋白区
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
7) Wet transfer buffer 1(PH: 8.3): （20－400kd）
50mM Tris 5.8g
380mM Glycine 29g
0.1% SDS 1.0g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
8) Wet transfer buffer 2(PH: 8.3) ＜80kd
25mM Tris 5.8g
190mM Glycine 29g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
9) blocking buffer:
5% milk 5g
TBST 100ml
※：奶粉为脱脂奶粉。
10) 10×TBS (PH: 7.6)
NaCl 80g
Tris 30g
Total: 1000ml
11) TBST (PH: 7.4)
NaCl 25mM
Tris 100Mm
Tween-20 0.2%
Total: 1000ml
12) 5×STOP buffer (PH: 6.7)
20% Glycerol 100ml
10% SDS 50g
250mM Tris 15.14g
用时取9.0ml，加入0.5ml β-ME和0.5ml 溴酚蓝，可制成sample buffer。