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Western Blot小问答

发布人:浩然生物 浏览 4149次【字号 】 发布时间:2010年01月03日 打印本页

1. 什么是western blot?
答:WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。

2. western blot 有什么优点?
答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便,特异性高。

3. western blot 的具体步骤是什么?
答:一. 制样(以提动物组织总蛋白为例),
1
) 组织洗涤后加入3 倍体积PBS0℃研磨。
2
) 加入5×STOP buffer
3
180W, 6mins0℃超声波破碎
4
5000rpm5mins 离心,取上清。
5
) 加入REB(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml
6
) 煮沸,10min
7
) 分装,于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。

二. 电泳(SDS-PAGE
建议欲检测抗原1030kd, 15%胶;30100kd, 10%胶;100200kd,用7.5
%胶。
1
)配胶(one pieceA.分离胶。单位:mlTotal: 8ml
7.5
10 15%
2×Sep. buffer 4 4 4
30
Gel.sol 2.0 2.7 4
ddH2O 1.9 1.2 0
TEMED 8ul 8ul 8ul
10%APS 80ul 80ul 80ul
B.
浓缩胶。单位:mlTotal: 3.5ml
3

2×Stacking. buffer 1.7
30
Gel.sol 0.35
ddH2O 1.4
TEMED 5ul
10%APS 50ul
2)
点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即:如果你的胶槽是5mm×1mm,
载荷面为:1mm×5mm=5mm2)
3
)电泳。开始用80V电压,但是当溴酚蓝至分离胶时,用100-120V电压。
4
)转移(一块胶)。
A.
半干法。
a.
取六张滤纸(Bio-Rad1mm),三张做上层滤纸,三张做下层。其中,
上层滤纸一定要比较干净,无污染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少
五分钟。
b.
准备硝酸纤维素薄膜,用时先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后,再用Transfer
buffer
浸泡。
c.
做三明治。阳极上铺三张下层滤纸,再浸泡过的膜,再铺胶,然后铺三
实验方法互助区——蛋白区
张上层滤纸,最后铺上三张上层滤纸,盖上阴极。注意每层之间不能有
气泡。膜上用铅笔画出胶的边缘。标上下。
d.
转移,0.8mA/cm2-3mA/cm2. 经验是:100kd-200kd,用2mA/cm22hrs;
30-100kd
1.0-2.0mA/cm240mins-1.5h10kd-30kd%用0.5-0.8mA/cm2
15mins-40mins.
B.
湿法。
a.
取四张滤纸,两张做上层滤纸,两张做下层。其中,上层滤纸一定要比较
干净,无污染。
b.
准备硝酸纤维素薄膜,用时先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transfer
buffer
浸泡。
c.
做三明治。
e.
转移。抗原≥100kd, 28V转移1h, 然后84V转移14-16h, ≤100kd, 则
63V
转移4-16h.

三封闭:5%牛奶4℃封闭过夜,或RT 1hr.

四第一步反应:5%牛奶或2BSA稀释抗体(称一抗),稀释比例按抗体说明,室温
孵育1hr

五洗涤:TBST 5 mins 3-5 次。

六第二步反应:将膜跟5%牛奶或2BSA稀释的2 抗一起孵育,室温1hr

七洗涤:TBST 5 mins 3-5 次。
八显色:

4. western blot
所需buffer 的配方是什么?
答:主要的buffer有:
1
2×Separation buffer (PH: 8.8)
0.75M TRIS.HCl 90.825g
0.2% SDS 10ml 20% SDS
Total: 1000ml
2) 30% gel Solution
0.8% kis-aciylamide 0.8g
29.2% aciylamide 29.2g
Total: 100ml
3
10 APS: 0.1g 溶于1.0ml ddH2O.
4) 2×Stacking buffer(PH: 6.8)
0.2M Tris 15.14g
0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS
Total: 500ml
5) 10×Running buffer(PH: 8.3)
250mM Tris 60.55g
1.9M Glycine 285.27g
1% SDS 20g or 100ml 20% SDS
Total: 2 liters
6) Semi-dry transfer buffer(PH:8.3):
48mM Tris 5.8g
39mM Glycine 2.9g
0.037% SDS 0.37g
实验方法互助区——蛋白区
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
7) Wet transfer buffer 1(PH: 8.3):
20400kd
50mM Tris 5.8g
380mM Glycine 29g
0.1% SDS 1.0g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
8) Wet transfer buffer 2(PH: 8.3)
80kd
25mM Tris 5.8g
190mM Glycine 29g
20% MeOH 200ml
Total: 1000ml
9) blocking buffer:
5% milk 5g
TBST 100ml
:奶粉为脱脂奶粉。
10) 10×TBS (PH: 7.6)
NaCl 80g
Tris 30g
Total: 1000ml
11) TBST (PH: 7.4)
NaCl 25mM
Tris 100Mm
Tween-20 0.2%
Total: 1000ml
12) 5×STOP buffer (PH: 6.7)
20% Glycerol 100ml
10% SDS 50g
250mM Tris 15.14g
用时取9.0ml,加入0.5ml β-ME0.5ml 溴酚蓝,可制成sample buffer


有用 没用    

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