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GENESCAN技术标准

发布人:浩然生物 浏览 6543次【字号 】 发布时间:2010年01月03日 打印本页
1 主要试剂
STR Pvimer                       Postive Control DNA
STR Buffer                       Allele Ladder
Gold Taq DNA Polymerase          Rox-350
2 主要仪器
DNA扩增仪(PE9700)
自动测序仪(PE377)
微型高速离心机
GeneScan软件
Geneotyper软化
3 操作步骤
3.1 基因组DNA提取——盐析法
3.1.1 操作流程
用方框图形式,按照GeneScan技术的先后顺序和技术要求、分割形成7个相对独立的实验阶段,以便合理安排分配试验时间,提高工作效经。
3.1.2 操作步骤:
    ①取0.1ml血样置于1.5ml EP管。
②加500μl TE缓冲液,充分混匀静置5分钟。
③13000rpm离心2分钟,用无菌移液管移弃上清液。
④加TE缓冲液重复②、③步一遍,然后用红细胞裂解缓冲液(RCLB),重复②、③步两遍。
⑤最后一次RCLB洗涤后,移去上清液,加入100μl DSP工作液,充分混匀直至沉淀块碎。
⑥56℃孵育2小时。
⑦95℃孵育10分钟。
3.1.3 纯化DNA
    ①加35μl高氯酸钠,混匀后13000rpm离心5分钟,小心吸取上清液。
②加2.5倍体积冷无水乙醇,沉淀DNA,12000rpm离心8分钟,弃上清液。
③加入1ml 70%乙醇洗涤DNA,10000rpm离心7分钟,弃上清液。
④置超净台内自然干燥后,加入100μl ddH2O,置4℃保存,待用。
 
提取基因组DNA                                   纯化DNA
(盐析法)                                    
 

 

       DNA定量
   
         扩 增
    
          电 泳
 

 

GeneScan
 

 

Genotyper
 

 

计算机分析处理
 

 

                      操作流程图
3.2 DNA定量
3.2.1 配制0.8%琼酯糖凝胶
3.2.2 将标准含量(20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl)的DNA样品和分子量大小DNA参照物置于干热器孵育5分钟,稍离心。
3.2.3 将分子量大小DNA参照物、标准量DNA及待测DNA样本各10μl依次加入胶中。
3.2.4 电压150V、电泳30分钟。
3.2.5 将胶置于紫外透测仪上,观察结果并照像。
3.2.6 与标准量DNA比对,估算并记录样本DNA含量。
3.3 基因扩增
反应体系为10μl,其中样本DNA 4.0μl,Master Mix 6.0μl。
3.3.1 根据定量结果将模板DNA量全部调至1ng/μl。
3.3.2 配制扩增反应液(Master Mix),(注:在冰上操作)。
STR 10×Buffer                     4.58μl
STR 10×Primer                     2.08μl
Taq DNA polymerase (5μ/μl)           0.17μl
以上反应物混合后用8联枪,加至每个样品扩增管中(在冰浴上操作)。
3.3.3 将模板DNA 4.0μl和已对照DNA4.0μl分别加入已标记好的96孔薄壁扩增管内,混匀后加橡胶垫盖紧管口,置PE 9700型扩增仪中。
3.3.4 十个位点扩增热循环参数的设置:
最初预变性95℃ 11min;94℃,1min;59℃ 1min;72℃,1min共28个循环,最后60℃,延伸45min;4℃保存备用。
3.4 电泳
采用美国PE公司制造的377A型自动测序仪进行。
3.4.1 预电泳条件:时间20min,功率50W,电流13mA,电压1KV。
3.4.2 FLS/G350混合液的配制。
FLS                 3.6μl
Rox-350             0.4μl
以上反应液混合后,用8联枪分置在48孔扩增管中。
3.4.3 DNA样本处理:将扩增产物用去离子水对倍稀释后取3μl,分别加入标记好有FLS/GS350混合液4μl的扩增管中并混匀。在第1孔和第48孔加入1μl STR等位基因标记物;第2孔和第47孔为已知对照DNA,第3~46孔为样本DNA,操作全过程均在冰浴上进行;混合物置PE9700扩增仪上进行95℃,5min变性,然后放置冰浴中备用。
3.4.4 电泳:按照扩增板上各样本的排列顺序,用8道加样器吸取样本0.8μl加至上样槽中,在第1和48泳道中为Ladder,第2和47泳道为P·C,第3~46泳道为样本DNA。
电泳条件:时间2小时30分钟,功率200W,电流强度60mA,电压30KV。
3.5 基因扫描
用GeneScan软件将电泳收集的电泳图谱信息经过电子计算机处理成数据信息。
3.6 基因分型
用Genotyper软件,依据数据信息与设计等位基因分子大小标记的内标比较被定义。以美国PE公司的等位基因标准物(Allele Ladder,AL)为参照物进行分型,等位基因按重复次数命名,电泳图谱中不同位点的等位基因显示出不同颜色,同一位点的不同等位基因为同一种颜色,它们的迁移率各不相同。电泳图谱中的颜色分为红、黄、蓝、绿。红色为Genescan-350[ROX],是设计的等位基因分子量大小标记物,在变性条件下产生的片段大小:50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350bp;黄色为NED,标记的基因位点有D5S818,D13S317和D7S820;蓝色为S-FAM,标记的基因位点有D3S1358,VWA和FGA;绿色为JOE,标记的基因位点有Amelogenin,TH01,TOPXt CAF1PO。

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