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Western Blot实验操作指南优化

发布人:浩然生物 浏览 5792次【字号 】 发布时间:2012年08月29日 打印本页

Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法,但是要将这种技术变成你的有利手段,并不容易。因此优化实验操作手册至关重要,但是,正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的,“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”,Ryan继续说道,“问题是大多数人都不知道何处需要优化。坦率地说,Western blot检测过程耗时太长。如果每个印迹实验都有花费你两天时间,那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢?”当然,类似抗体质量,封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色,让我们来仔细看看,现今还有哪些优化的技巧和工具。
加入合适数量的蛋白
虽然步骤优化至关重要,但是传统的Western Blot整个过程本身过长确实也带来了困难。Short相信一个成功的Western Blot实验操作指导中,最重要的因素之一就是确定每份凝胶中加入的蛋白量。
“这是非常重要的,因为大多数进行WB实验的研究人员都有一个兴趣蛋白,需要与内参(看家蛋白)比对”,Short说,“如果您的兴趣蛋白是一个低表达的蛋白,而你的内参蛋白是一种高表达的蛋白,那么在检测的动态范围内就必须有两种蛋白,以确保结果的可靠性。因此可能需要加大低表达蛋白的数量,大概有50-60ug蛋白,但在这个量上内参蛋白信号可能会远远超出了线性检测范围了。了解这些动力学对于Western blot获得好结果十分重要。
有效的封闭:脱脂牛奶以外
使用正确的封闭液将获得完全不同的一个结果。虽然牛奶是经常被使用到的封闭液,但现如今这种封闭液也许不如高质量商业化的封闭液。“封闭液应该结合到膜上不与相应抗体结合的区域”,Thermo Scientific公司Priya Rangaraj表示,“如果做不到这一点,你会看到斑点和增加的背景”。
目前Western市面上一些封闭液包括Thermo Scientific的StartingBlock Blocking Buffer,LI-COR Bioscience公司的Odyssey Blocking Buffer,以及来自Bio-Rad的PBS(含有1%酪蛋白封闭液)。
“研究人员耗费大量的时间去去调整,检测各种一抗和封闭液”,“抗体的性能在与与正确的封闭液作用的时候,会得到显著改善”,LI-COR Bioscience公司的生化产品技术专家Shawn Mischnick说。
化学发光检测:选择一个长时稳定的信号
优化过程中另外重要的一点就是,检测信号的质量和稳定性,Advansta公司首席科学家Dmitry Bochariov说,“底物信号长时稳定,这有助于减少底物和培养基之间不一致性造成的相关变量,以及当印迹成像和曝光时产生的变量,”Bochariov说,“控制和复制这些变量是非常困难的,因为它们涉及人工处理的印迹,带有保护层,并且与记录工具,或者成像系统设备等其它人为因素有关。这些因素长期稳定的化学发光输出,可以大大弥补所有这些变量。”
比如说Thermo Scientific化学发光底物SuperSignal Substrates,就有针对三个不同靶标水平的试剂(皮克,中级豪微克,低级飞克)。
放大低表达蛋白信号的另一种工具就是Thermo Scientific的新产品:SuperSignal Western Blot Enhancer,这是一种增强剂,包含有两种试剂:抗原预处理液和一抗稀释液,能将信号强度和灵敏度提高3-10倍,从而显著降低背景,并增强低丰度和弱免疫反应性抗原的检测。
SuperSignal增强剂使用起来也很简单。在转印之后,封闭之前,用足量的抗原预处理液浸泡膜10分钟。一抗杂交前用一抗稀释液稀释一抗。其他操作均按照Western blotting的标准操作流程进行。此增强剂可用于PVDF膜或硝酸纤维素膜,并与荧光、比色法和化学发光检测兼容。
“增强剂不仅增加了信号,使得抗原表位更加容易接近一抗,而且也降低了背景,”Rangaraj说,“这对于低丰度,或弱免疫反应的抗原或蛋白,特别有用的”。而且,配合上Thermo Scientific的MYECL™成像仪(能进行WB结果数字图像,检测和获取)“基于CCD的成像系统具有相比于传统X光片,高出两倍的敏感性,以及十倍的动态范围,”Rangaraj说。


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