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PeproTech细胞因子和重组蛋白溶解必读

发布人:浩然生物 浏览 6068次【字号 】 发布时间:2014年09月04日 打印本页

大家知道,PeproTech的所有细胞因子和蛋白均为冻干粉,这使得运输非常便捷,只要常温即可。而且,细胞因子和蛋白冻干粉非常稳定,在-20o C或-80o C条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解,然后以液体形式加到培养体系或注射入动物体内。溶解步骤非常关键,因溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活,这也是很多用户在实际使用中经常遇到的问题。
应该如何进行正确的溶解呢?
下面我们以Recombinant Human IL-4 (重组人IL-4,产品编号:200-04)的说明书为例,对细胞因子或蛋白的溶解方法进行详细的阐述。
拿到重组人IL-4的说明书后,您会发现有一段关于Reconstitution(重悬)的叙述,这段内容含有溶解相关的所有信息。
1. Centrifuge the vial prior to opening
第 1 步:开盖前离心试剂管
PeproTech的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中,为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上,所以在打开塑料瓶盖前,需将冻干粉通过离心收集到管底,以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。
有很多用户会问一个问题,即应该用多少转速、多长时间离心试剂管,才能达到良好的收集效果?
答:有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有一个Spin键,按了此键后,离心机会自动快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm),上升到最高点后速度即刻下降,直至停止旋转,整个过程大约30s。这个Spin键足以很好的将细胞因子或蛋白收集到管底。
但有些实验室没有这样的高速离心机,只有最高转速为4000-4500rpm的离心机。这种情况下,需3000-3500rpm离心5min,也能达到类似的效果。
2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.
第 2 步:用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml ,不可振荡。
这个步骤即为溶解步骤,非常重要。
1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉
用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人IL-4需用水溶解,而重组人IL-2 (产品编号:200-02)则需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解,重组人TGF-beta1 (产品编号:100-21)需用10mMCitric Acid (柠檬酸),pH3.0溶解,重组人FGF-basic(产品编号:100-18B)需用5mMTris,pH7.6溶解,重组人FGF-10(产品编号:100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸钠),pH7.4溶解,重组IL-13(产品编号:200-13)需用20mMMHCl溶解。(注:即使同一重组细胞因子或蛋白,不同批次的溶解方法也可能有所不同,因此上面的叙述仅供参考。具体应该如何溶解应以相应批次的官方说明书为准)。后续的文章中将对各种溶解液的配制方法进行详细的阐述,望继续关注。
经常有用户会问,为什么会有这么多种溶解方法?
答:我们知道,蛋白的溶解性与很多因素有关,其中比较重要的是pH值和离子强度。PeproTech的细胞因子或重组蛋白在出厂前均经严格测试,说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的pH值和离子强度与说明书中所标明的不符,很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解,这样所配得的细胞因子或重组蛋白必然活性不够或丧失。
有不少用户没注意说明书上的描述,而是根据习惯,直接用PBS或培养液(1640或DMEM等)等溶解细胞因子或蛋白的冻干粉。这样做可以吗?
答:有时可以,要看具体情况。PeproTech的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是PBS,此时千万不能用PBS或培养液直接来溶解,具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子,如重组人KGF(产品编号:100-19)和重组人FGF-23(产品编号:100-52)等,说明书上的溶解液即为1x PBS,此时用PBS溶解完全没问题,那么用培养液溶解也是可以的,不过最好还是用先用PBS溶解,然后再用培养液稀释。
2) 一定要溶解到指定的浓度。
蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性,这个范围就是说明书上所标明的浓度范围,该例为0.1-1.0 mg/ml。这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。如重组人FGF-6(产品编号:100-30)为0.5-1.0mg/ml,而重组人Activin B(产品编号:120-15)则一定要是0.5mg/ml。
高于或低于该浓度范围会有什么问题呢?
答:首先,细胞因子或蛋白会不稳定,即很容易出现活性下降的现象。其次,高于这个浓度范围,可能会超过该蛋白的最大溶解浓度,即蛋白无法完全溶解。再者,高于或低于该浓度范围,蛋白可能会出现聚集(aggregation),最终结果还是部分蛋白未溶解,导致蛋白活性的减弱。
3) 一定不能振荡(vortex)。
这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。
有用户会问,若想保证溶解液与冻干粉充分混匀,以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解,该怎么办呢?
答:多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的,一般我们用移液枪的枪头轻吹几下,即可


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