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alamar Blue的用法

发布人:浩然生物 浏览 4496次【字号 】 发布时间:2012年04月18日 打印本页

Alamar-Blue 检测试剂为细胞增殖和细胞毒性检测提供了一种简便、快速、可靠、安全的方法,适用于高通量检测实验。此试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性,而在还原状态下,转变为呈粉红或红色荧光的还原产物,其吸收峰为530-560nm,而散射峰为590nm。
在细胞增殖过程中,细胞内NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高,处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中,使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。最后用普通分光光度计或荧光光度计进行检测,吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。
与台盼兰、TTC、MTT、MTS等分析法相比,Alamar-Blue具有更多的优势。Alamar-Blue采用单一试剂,可以连续、快速地检测细胞的增殖状况。由于Alamar-Blue对细胞无毒、无害,不影响细胞代谢、细胞因子分泌、抗体合成等,可以对同一批细胞的增生状态进行连续观察和进一步的实验观察。其适用于细菌、酵母类、昆虫类、鱼类、哺乳类等多种细胞,以及贴壁细胞与非贴壁细胞的检测,可以广泛用于细胞增殖、细胞毒性以及病原微生物的快速检测与鉴定。
非贴壁细胞和贴壁细胞都适用。所有操作在无菌条件下进行。避免污染细胞,因为微生物污染也会还原alamarBlueTM,培养基中应添加抗生素如青霉素G(1U/ml)、两性霉素B(amphotericin B,0.0025ug/ml)。
氧化还原指示剂是pH敏感的,推荐使用磷酸缓冲液。10%胎牛血清对比色法检测无影响,但是会淬灭部分荧光;因此,用荧光法检测时对照溶液中需添加10%BSA。酚红对检测也有一定影响,结果会上调0.03%。一般来说,应使用非还原性的培养基,如RPMI1640、Hank’s-Eagle或 Dulbecco’s-Eagle。
在特殊系统中使用时,细胞密度、孵育时间、培养基成分及使用浓度等条件需要先优化。
收集需检测的细胞,以优化的密度铺于加入10%(v/v)alamarBlueTM的新鲜培养基上,
1.细胞培养:RPMI培养基,添加HEPES、10%胎牛血清、1%谷氨酸盐、适当的抗生素;
2.细胞覆盖率达80%时,用胰酶消化铺于微孔板中,密度在每孔825~80000个细胞。
3.1个小时后,加入alamarBlueTM,37℃ 5%CO2培养
4. 到预定的时间点后检测alamarBlueTM的还原情况
注意:若检测的还原度不够,可选择继续培养再检测,这是该方法的一大优越之处
研究特殊药物对细胞周期的影响(如roscovitine,一种抗癌药、周期蛋白激酶抑制剂),胰酶消化细胞、收集并铺于含药物的培养基上,37℃ 5%CO2培养2天;除去之前的培养基换上含10%(v/v)alamarBlueTM的新培养基,在预定的时间点检测其还原度.


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