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免疫组化

发布人:浩然生物 浏览 7489次【字号 】 发布时间:2010年01月03日 打印本页

一 免疫组化的原理
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。
二 免疫组化的实验步骤
固定
1.浸入式:将组织样本直接放入固定液(4%的多聚甲醛等固定液)内,4℃浸泡2小时,不超过12小时
2. 灌注式:主要适用于脑部组织,用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液
切片
1.石蜡切片:
     (1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水;
     (2)将组织浸入二甲苯中透明;
     (3)在溶蜡箱中,组织被石蜡包埋;
     (4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上,切成薄片,并将薄片贴于玻片上;
     (5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇;
注意:石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基,常用方法有微波
   热修复,煮沸热修复,酶消化方法
2. 冰冻切片:将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却,然后切片机切片,并将片贴于玻片上
封固
1.防止脱片,可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响,可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)
3.避免内源生物素的影响,可以鸡蛋清或卵白素进行封闭;
4.避免非特异性染色,可以用二抗来源的血清进行封闭
染色
1.滴加稀释后的一抗,4℃过夜,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次;
2.滴加稀释后的二抗,37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次;
显色:选择与二抗配套的显色系统,进行反应,PBS终止反应后,用苏木素村然胞核,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,37℃干燥48小时,显微镜下观察


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